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简介?

水溶性维生素 (WSV) 主要由复合维生素 B 组成，是许多食品，尤其婴儿配方奶粉的基本成分。这些维生素在代谢途径中发挥着关键作用，日常饮食摄入可以产生显著健康获益。?

由于美国食品药品监督管理局 (FDA) 制定了这些维生素的每日营养推荐值，因此食品和补充剂生产商以及独立检测实验室需要能够定量鉴定该类产品中的维生素含量。在进行强化食品分析时，由于维生素浓度范围较广，与每日容许摄取量保持一致尤其具有挑战性 (见表 1)。例如，在婴儿牛奶中，维生素 B12 (氰钴维生素) 的浓度为 1-2ppb，而维生素 B2 (核黄素) 的浓度则高达 1000 倍 (1-2 pm)。因此，任何定量分析方法都必须能够适应这种广泛的浓度分布。

我们提出了一种 LC-MS/MS 方法，一次进样即可定量分析 B 族维生素。分析的维生素包括维生素 B1 (硫胺素)、B2 (核黄素)、B3 (烟酸)、B3*(烟酰胺)、B6 (吡哆醇)、B7 (生物素)、B9 (叶酸) 和维生素 B12 (氰钴胺)，使用三个内标。采用简单的液液萃取法从婴儿配方奶粉中提取维生素。样品提取与快速分析方法 (<6 分钟) 相结合具有稳定性 / 可靠性，并且耗时少。?

实验?

硬件 / 软件?

液相色谱串联质谱分离使用 EClassical3200L-MS2Vertical 9100 液相质谱联用系统，所有仪器控制、分析和数据处理均使用液质软件平台执行。?

方法参数?

LC 和 MS/MS 方法参数分别见表 2 和表 3。

溶剂、标准品和样品制备?

使用的所有溶剂、试剂和稀释剂均为 HPLC 级，并通过 0.22-um 尼龙针头式过滤器过滤。?

对于所有样品的稀释，使用 5-mM 甲酸铵，并用 10% 甲酸调整 pH 为 4.9。?

所有 B 族维生素标准品，包括 B1 (硫胺素)、B2 (核黄素)、B3 (烟酸)、B3*(烟酰胺)、B6 (吡哆醇)、B7 (生物素)、B9 (叶酸) 和 B12 (氰钴胺) 均从 Sigma-Aldrich Inc.,Saint-Louis,MO. 购买。?

为了校准和定量，使用了三个内标：维生素 B1"(硫胺素；?13C4?C8?H17? N4?OS+)、B7"(生物素；?C10?D2?H14? N2?O3? S) 和 B2'(核黄素；?13C4?C13?H2015? N2? N2?O6?))，全部来自 Sigma-Aldrich Inc.。校准 B3、B3*、B6 和 B1 时采用 B1'，校准 B7、B9 和 B12 时采用 B7，校准 B2 时采用 B2。?

分析样品包括两种商购获得的婴儿配方奶粉，标记为 IF1 和 IF2。?

表 3.MS/MS 参数

为了防止可能的标准品或样品不稳定性，所有储备和工作标准品均冷藏存储，直到使用；所有制备样品均在 4 小时内进行分析，并且只使用琥珀色 2mL LC 小瓶。?

所有标准品和样品均通过 0.22-um 尼龙过滤器过滤。?

实验?

标准品制备?

在 250mL 容量瓶中制备 40ug/mL 的 B2、B9 和 B7 储备标准品。由于这三种维生素在碱性条件下溶解佳，所以首先在烧瓶中加入 50mL0.05% 氢氧化铵?(NH4?OH)，摇晃直到标准品完全溶解。然后加入稀释剂，定容至刻度。?

直接使用稀释剂制备 40ug/mL 的 B3、B3*、B6 和 B1 储备标准品和 5pg/mL 的 B12 储备标准品。?

对于工作标准品，向 100mL 容量瓶中加入三种储备液各 25mL 以及 25mL 稀释剂。摇晃后，将烧瓶冷藏。本工作标准品也作为校正浓度级别 6 的标准溶液，除 B12 (1.50ug/mL) 外，各维生素含量均为 10pg/mL。?

加入各同位素的维生素标准纯品，制备内标储备液 (ISTD)，如下：将 2mg 的 B1、5mg 的 B7 和 1mg 的 B2 分别转移到 20mL、250mL 和 10mL 容量瓶中。为了辅助溶解，首先将 B1 和 B2' 标准品转移到每个容量瓶，用 1mL 0.05%?NH4?OH分 5 次润洗。然后用稀释剂分别将三个容量瓶定容至标线?；竦玫?B1 和 B2 储备浓度为 10ug/mL，B7 为 20pg/mL。?

通过对工作标准品进行连续稀释，制备 6 个校准浓度级别?；竦玫奈嘏ǘ燃?4。由于维生素 B12 的 DV 指南值明显较低 (0.006mg)，因此使用较低的浓度范围对其进行校准。每批样品运行前，分别移取各校准浓度级别标准溶液 50mL 至 50mL 容量瓶中，加入 50μL ISTD B1、B2 和 250μL ISTD B7，使内标浓度为 0.1ug/mL。注：如果可用的任何校准浓度级别标准溶液低于 50mL，ISTD 应相对可用量成比例添加。所有校准物均一式三份进样。?

表 4. 各校准浓度级别的维生素 B 浓度

样品制备?

在皮重 50mL 离心管中称取所需量，然后加入 20mL 稀释剂，制备两种婴儿配方奶粉 (标记为 IF1 和 IF2)。所需量根据每种产品标示量中奶粉与水的建议比例确定。每个离心管脉冲涡旋 15 分钟，加入 ISTD B1 和 B2'40μL 以及 ISTD B7'200μL，使内标浓度为 0.2ug/ml，样品中内标加标至 0.2ug/mL，在接下来样品制备过程中，内标浓度将被稀释 2 倍。?

取 20mL 乙腈，用 10μL 的 10% 甲酸酸化，然后加入每个试管。随后脉冲涡旋 5 分钟，以 7800rpm 离心分离 10 分钟。加入酸化的 ACN 引起蛋白质沉淀 / 淀析，从而可以通过离心除去脂肪 / 固体物质。然后从三个试管中分别小心地转移 10.0mL 上清液到 50mL 离心管中，并干燥至约 mL。然后，每管中装入稀释剂至 10mL 刻度，脉冲涡旋 3 分钟，并以 7800rpm 离心 5 分钟。各取 1mL 上清液过滤到 2mL 小瓶中。所有样品一式三份进样。?

结果和讨论?

使用规定的方法参数，图 1 显示了重复进样 12 次浓度级别 5 的标准溶液各 MRM 通道的谱图叠加。所有 8 种维生素均有良好分离度，在不到 4 分钟内洗脱，重复进样 12 针的谱图叠加，展现出了的色谱重现性。?

图 2 显示了维生素 B1 和 B12 的校准曲线，表现出的线性 (?R2≥0.999；?n=3)。维生素 B2、B3*、B7 和 B12 采用 6 级校准。对于维生素 B1、B3、B6 和 B9，使用 5 级校准。所有 8 种维生素的?R2>0.996。

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